双特异性抗体、三特异性抗体及多特异性抗体已成为抗体领域的后起之秀。在双抗接连取得研发突破的同时，三抗、多抗的研发序幕也已拉开。据医药魔方NextPharma数据库，目前全球有超50款三抗及多抗候选分子在研。科学家们希望发挥三抗、多抗同时调控多个靶点的优势，为癌症、自身免疫性疾病、HIV感染等疾病提供更有效的疗法。
2月23日，发表在Nature杂志上的一篇论文中，来自Sanofi R&D的科学家们带来了三抗研发方面的一项里程碑突破。研究证实，在人源化小鼠模型中，靶向HER2的三特异性抗体有效诱导了乳腺癌消退。
来源:Nature
具体来说，在这项研究中，科学家们设计了一款HER2/CD3×CD28三特异性抗体（通过CD3和CD28双信号通路刺激T细胞的激活和增殖），并调查了这类三抗抵抗乳腺癌的潜力。
知识卡：CD3是T细胞受体(TCR)的一部分，正常通过结合抗原分子来识别异常细胞。HER2/CD3×CD28三抗可与CD3结合驱动T细胞的激活，进而导致癌细胞杀伤，以及毒性细胞因子的产生和释放。CD28也在T细胞上表达，HER2/CD3×CD28三抗与该蛋白结合可驱动一种名为Bcl-xL的蛋白质的表达（Bcl-xL的作用是阻断T细胞死亡），从而提升T细胞杀伤癌细胞的持久性。
研究首先证实了HER2/CD3×CD28三抗在刺激CD8 T细胞细胞毒性方面的作用。使用该三抗后，CD8 T细胞中颗粒酶的表达增加了6.8倍。接着，科学家们调查了这款三抗在人源化小鼠中的抗肿瘤作用，在原代人CD3+T细胞重组的免疫缺陷NSG小鼠体内评估了HER2/CD3×CD28三抗抑制肿瘤生长的能力。
人源化小鼠模型中HER2三特异性抗体对肿瘤生长的影响（来源：Nature）
研究结果显示，在剂量低至10μg kg−1时，HER2/CD3×CD28三抗完全抑制了HER2-high HCC1954 乳腺癌细胞(453,780 molecules per cel)。研究还测试了HER2/CD3×CD28三抗在HER2-low ZR-75-1细胞系（52,045 molecules per cell）中的疗效，结果显示，剂量低至10 μg kg−1时，HER2/CD3×CD28三抗依然能够诱导肿瘤消退。这些结果表明，在HER2高表达和低表达的肿瘤中，HER2/CD3×CD28三抗均能介导有效的肿瘤消退。
进一步，科学家们想要调查T细胞亚群在HER2/CD3×CD28三抗介导的肿瘤消退作用中的作用。研究团队将纯化的CD3、CD4或CD8细胞过继转移到移植了HCC1954乳腺癌细胞的人源化小鼠体内。结果显示，过继转移纯化的人CD3或CD4细胞可刺激体内肿瘤接近完全消退。相比之下，单独过继转移人类CD8细胞表现出小的抗肿瘤效应。研究者们认为，这可能是因为缺乏辅助性T细胞的情况下CD8细胞生存不佳。这些结果强调了CD4细胞在介导肿瘤消退中的重要性。
HER2三特异性抗体刺激的CD4+T细胞抑制了HER2+乳腺癌和胃癌细胞的细胞周期进展和/或增殖（来源：Nature）
为了进一步探讨CD4细胞发挥抗肿瘤作用的机制，科学家们调查了是否人CD4细胞会对HER2+人乳腺癌和胃癌细胞系产生直接抑制作用。他们将CD4细胞与肿瘤靶标及HER2/CD3×CD28三抗或阴性对照IgG在体外孵育24小时，然后测定细胞周期分布。结果显示，与对照组相比，三抗处理组所有的10种细胞系均在G0/G1期显著积累，表明G1/S期生长停滞。相比之下，肿瘤细胞系与HER2/CD3×CD28三抗以及CD8细胞一起孵育时，细胞周期分布变化极小，表明是CD4细胞，而不是CD8细胞促进了肿瘤生长停滞。这些数据表明，HER2/CD3×CD28三抗通过独特的互补效应机制刺激CD4和CD8细胞裂解人乳腺癌细胞。
HER2三特异性抗体刺激的CD4+ T细胞抑制了乳腺癌细胞系HCC1954中细胞周期进展和/或增殖并刺激了促炎通路（来源：Nature）
基因表达分析研究显示，当暴露于三特异性抗体和CD4细胞时，乳腺癌细胞（HCC1954细胞）细胞周期/细胞分裂通路的基因簇如预期的那样显著下调，此外，值得注意的是，促炎反应，如TNF和IFNγ通路显著上调。与此效应一致，TNF信号通路下游的许多基因显著上调，包括CXCL10、CXCL11和CCL5。CXCL10是单核细胞/巨噬细胞、T细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞的主要趋化因子，而CXCL11和CCL5是T细胞的趋化因子。当CD4细胞与肿瘤靶细胞和三特异性抗体孵育时，上清液中也检测到大量TNF和IFNγ。相比之下，暴露于CD8细胞时，尽管观察到innate immunity–IFNγ–type Iinterferon通路的上调，但肿瘤细胞细胞周期/细胞分裂通路的表达并没有降低。
接着，科学家们利用中和抗体进行了细胞因子中和实验。结果显示，抗TNF（非抗IFNγ或IFNα）中和抗体显著阻断了三特异性抗体在CD4细胞存在下对HER2-high MDA-MB-453乳腺癌细胞系的杀伤活性。相比之下，抗TNF中和抗体对于CD8细胞存在下的三抗杀伤活性没有影响。TNF对CD4细胞抗肿瘤活性的重要性也在HER2-high MD-MB-453细胞系和HER2-low ZR-75-1细胞系中得到证实。这些数据表明，CD4和CD8 T细胞通过不同的机制发挥其抗肿瘤活性。此外，这些发现证实，CD4细胞可直接影响肿瘤细胞周期进展，这是一种以前未被认识到的恶性肿瘤免疫控制机制。
为了探究HER2/CD3×CD28三抗的潜在毒性，研究者们进行了一项探索性的非人灵长类动物(NHP)毒理学研究。结果显示，在NHP临床前毒性研究中，HER2/CD3×CD28三抗耐受良好，首次给药引发短暂的炎性细胞因子释放，多次给药后细胞因子释放衰减。
总结来说，该研究证实，HER2/CD3×CD28 三抗可刺激T细胞激活，并提供诱导T细胞增殖的生存信号。而这些被激活的T细胞不仅能够抑制HER2高表达的乳腺癌细胞，还可有效裂解HER2阴性乳腺癌细胞系（表达低至中等水平的HER2），表明HER2/CD3×CD28 三抗可能是对基于HER2的治疗无响应的大多数乳腺癌患者的一个潜在希望。
此外，研究证实，HER2/CD3×CD28三抗诱导的肿瘤消退涉及先前未被认识的机制，包括CD4细胞介导的肿瘤细胞周期阻滞及促炎反应，这些发现值得进一步研究。
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