王红阳院士团队再发文：发现促进肝癌发生的新机制
2023年10月13日，海军军医大学王红阳院士团队在《Cell Press》细胞出版社旗下交叉学科期刊《iScience》上发表了题为“N6-Methyladenosine Modification Promotes Hepatocarcinogenesis through Circ-CDYL-enriched and EpCAM-positive Liver Tumor-Initiating Exosomes”的研究论文。该团队表征了一种可能由肝肿瘤起始细胞释放的外泌体亚群：肝肿瘤起始性外泌体（Liver Tumor-Initiating Exosomes , LTi-Exos）。该亚群外泌体具有高Circ-CDYL（环状RNA-CDYL）含量且EpCAM+的特征，并且被证实可以通过肿瘤微环境影响肝癌细胞的干性。机制探索中，团队证实METTL3依赖性的m6A修饰能够通过YTHDC1调控Circ-CDYL在肝癌细胞内的反向剪接，同时通过hnRNPA2/B1促进Circ-CDYL包裹进入LTi-Exos。本研究阐明了m6A修饰通过LTi-Exos对肿瘤微环境进行调节并促进肝癌发生的作用和机制，为LTi-Exos作为潜在的肝癌早诊标志物和早期治疗靶点的应用提供了理论依据。
研究背景
肝细胞癌(HCC)是全球男性癌症相关死亡的第二大原因，其全球患病率不断上升，突显出需要有效的策略来减轻肿瘤负担。先前的研究表明，肿瘤分期在HCC预后中起着至关重要的作用:所有分期HCC患者的5年总体生存率低至14%，非常令人失望。然而，极早期(巴塞罗那临床肝癌0期，BCLC 0期)和早期(BCLC A期)HCC患者在积极手术治疗后的5年生存率分别接近90%和50%-70%。亚组分析显示，BCLC A期HCC患者的较佳中位生存时间为53个月。BCLC B/C/D期患者的中位生存时间分别仅为16、7和3个月。由于HCC早期和晚期患者临床转归的显著差异，早期筛查和诊断HCC高危人群的重要性不言而喻。不幸的是，尽管积累的数据鼓励HCC的早期发现，但HCC早期缺乏特异性症状，超声检查性能不佳，以及筛查HCC的生物标志物AFP不足，在临床上造成了不可避免的严重障碍。由于目前可用的HCC筛查和早期诊断方法的不足，需要在临床实践中开发一种创新的充分监测模式。
外泌体是由各种类型的细胞通过内泌体的限制膜向内出芽而释放的特化的、纳米大小的、膜结合的内吞囊泡。大量的各种DNA、mRNA、lncRNA、microRNA和circRNA的货物被包裹并稳定在外泌体中，使它们能够在与靶细胞融合时传递细胞内货物并参与细胞间通讯。肿瘤细胞分泌的外泌体与癌症的恶性过程有关。外泌体及其货物在胰腺癌、前列腺癌和胶质母细胞瘤等癌症的诊断和进展中的作用预计是至关重要的。然而，肝癌来源的外泌体在HCC恶性肿瘤中的作用以及外泌体在HCC诊断和治疗中的临床意义尚不清楚。
近期发现的非编码RNA称为circRNA，其结构是共价闭合的，并且没有3 '或5 '游离端，通常以组织或发育阶段特异性的方式表达。由于circRNA对核酸外切酶活性的组成性抵抗，因此在生物过程中异常稳定。越来越多的证据表明，在体液中含有circRNA的外泌体由于其选择性货物包装和与起源细胞的相似性，已被确定为有前景的癌症诊断生物标志物。
研究过程及发现
研究人员通过组织微阵列，分析了BCLC 0期HCC组织和非肿瘤邻近组织中circRNAs的全基因组差异表达。在所鉴定的环状RNA中，Circ-CDYL是极早期HCC肿瘤组织中表达上调明显的环状RNA。CDYL基因位于Y染色体上，编码一种有助于基因转录抑制的蛋白质，并负向调节哺乳动物精子发生和神经系统形态发生。Circ-CDYL是由CDYL基因第二外显子的头尾剪接产生的。Circ-CDYL在极早期HCC中特异性高表达，提示Circ-CDYL在肝脏肿瘤起始中具有潜在的致癌功能。
研究人员通过直接研究早期HCC患者血浆来源的外泌体来研究Circ-CDYL的细胞外释放模式。与从健康供体中分离的外泌体相比，从早期HCC患者分离的外泌体中检测到Circ-CDYL水平升高。这些发现表明，在早期HCC中外显体Circ-CDYL的高表达可作为开发高危人群联合筛查或早期诊断生物标志物的潜在工具。
在本研究中，研究人员发现Circ-CDYL的过表达增加了HCC细胞系细胞内和外泌体EpCAM的表达。前期研究报道EpCAM是AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路的靶点，由Circ-CDYL驱动。因此，研究人员提出Circ-CDYL增加了EpCAM+外泌体，因为来自Circ-CDYL过表达的细胞的外泌体包裹了更多的EpCAM。
研究人员在之前的研究中证实Circ-CDYL通过提高HDGF和HIF1AN的表达来促进HCC, HDGF和HIF1AN通过激活PI3K-AKT信号通路导致C-MYC和SURVIVIN的上调，并通过NOTCH通路抑制SURVIVIN的转录。在机制上，LTi - exos也激活了Circ-CDYL细胞内表达升高的信号通路。
在本研究中，研究人员证明过表达METTL3可以增加m6a修饰的Circ-CDYL的比例，提高Circ-CDYL的表达，而使用STM2457特异性抑制METTL3酶活性则会产生相反的效果。正如预期的那样，METTL3增强了HCC细胞系的干细胞样特性，使用STM2457抑制METTL3可以在体外和体内抑制HCC的肿瘤生长。
在这项研究中，研究人员确定m6A修饰可以通过两种不同的机制调节Circ-CDYL的作用:第一种机制涉及细胞内生物发生和对前cdyl的线性或反向剪接的偏好，第二种机制涉及通过封装到外泌体的细胞外输出。
研究人员发现mettl3依赖性m6A修饰Circ-CDYL可协同提高其细胞表达和外泌体水平。研究人员进一步研究了利用这些Lti - exos进行早期HCC诊断和监测的可能性。通过分析BCLC 0期和A期HCC患者血浆中分离的外泌体，研究人员证实早期HCC患者EpCAM+外泌体比例明显升高，Circ-CDYL和AFP水平升高。
LTi-EXOS通过发挥类似肿瘤诱导细胞的功能并通过肿瘤微环境促进肝癌发生
研究结论
本研究表征了一种肝癌相关外泌体亚群LTi-Exos，其具有高Circ-CDYL含量且EpCAM+的特征，同时阐明了Circ-CDYL的METTL3依赖性m6A修饰在肝癌中的致病作用和机制：一方面，Circ-CDYL的m6A修饰通过YTHDC1促进Circ-CDYL的反向剪接，从而提高其胞内表达水平；另一方面，Circ-CDYL的m6A修饰通过hnRNPA2/B1促进其包裹进入LTi-Exos，并终通过调节肿瘤微环境导致肝癌的发生。LTi-Exos与传统指标AFP相结合，有望为早期诊断及监测肝癌提供一种新的潜在的液体活检标志物。
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