湖南大学张英杰团队：揭示结肠癌治疗新方法
7月22日，湖南大学张英杰研究团队在期刊《Clinical And Translational Medicine》上发表了题为“LncRNA CARMN m6A demethylation by ALKBH5 inhibits mutant p53-driven tumour progression through miR-5683/FGF2”的研究论文，本研究中，研究人员阐明了CARMN在携带突变p53的结直肠癌患者中表达水平降低，这归因于其丰富的m6A甲基化，这在体外和体内促进了癌症的增殖、侵袭和转移。进一步的研究表明，ALKBH5作为CARMN的直接去甲基化酶，靶向477个甲基化位点，从而保留了CARMN的表达。然而，突变p53与ALKBH5启动子的相互作用阻碍了其转录，增加了CARMN上的m6A甲基化水平。随后，YTHDF2/YTHDF3识别并降解m6A修饰的CARMN。同时，过表达CARMN在体外和体内显著抑制了结直肠癌的进展。另外，研究人员鉴定出miR-5683是lncRNA CARMN的直接下游靶标，通过协同下调FGF2表达发挥抗肿瘤作用。本研究揭示了CARMN在携带突变p53的结直肠癌中的调节者和功能机制，可能为基于去甲基化的癌症诊断和治疗策略提供见解。研究表明对CARMN的m6A甲基化是导致突变p53获得性功能增强并引发结直肠癌恶性进展的关键因素，这一发现为癌症治疗提供了一种有前景的方法。
研究背景
目前的研究表明，人类基因组中约90%被转录成RNA，但其中只有不到2%含有编码蛋白质的基因。尽管被称为“垃圾DNA”，但人类和小鼠基因组中仍有超过80%被转录成各种RNA物种，如lncRNAs（长非编码RNAs）、miRNAs（微RNAs）、siRNAs（小干扰RNAs）和piRNAs（piwi介导的RNAs）。lncRNAs的特点是长度超过200个核苷酸，没有明显的编码蛋白质的能力，在不同的生理和病理条件下，在转录、翻译和翻译后水平上发挥着关键作用。显然，尽管缺乏广泛的开放阅读框，但lncRNAs作为RNA分子发挥着关键的生理功能。lncRNAs的活性由癌症中RNA结合蛋白和miRNA介导的途径之间的复杂相互作用决定。此外，人类基因组中lncRNAs的发现和特性研究正在迅速扩大，凸显了非编码RNA生物学动态变化的景观。
CARMN(心脏中胚层增强子相关非编码RNA)是平滑肌细胞中高度丰富和进化保守的特异性长链非编码RNA。近期的研究发现，CARMN是MIR143/145簇的宿主lncRNA，在心肌细胞和平滑肌细胞分化以及表型调控中发挥重要作用。值得注意的是，在体外实验中，CARMN的早期缺失是驱动VSMCs(血管平滑肌细胞)向致动脉粥样硬化表型转化的关键事件，同时也加速了体内动脉粥样硬化的进展。沉默CARMN为动脉粥样硬化提供了一个有前景的治疗途径，它提供了传统降脂或抗炎策略之外的新靶点，因为它可以有效抑制动脉粥样硬化斑块中的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖。然而，关于lncrna参与调控突变型p53诱导的结直肠癌的研究仍然很少。
研究进展
研究人员分别在12、24、36、48和60 h用细胞计数试剂盒(cck -8)检测细胞活力，检测ALKBH5在细胞中的功能。与近期的一篇报道一致，在SW480细胞中，敲低ALKBH5显著增加了细胞的增殖和迁移率，而过表达ALKBH5则观察到相反的结果。采用流式细胞术检测过表达和敲低ALKBH5对SW480细胞凋亡的影响。此外，敲除ALKBH5诱导细胞周期停滞在S期。细胞划痕和迁移实验显示，培养24、48 h后，敲低ALKBH5的SW480细胞划痕距离和迁移率降低。综上所述，这些发现表明突变型p53直接结合到ALKBH5区域的启动子上，抑制其转录，下调ALKBH5蛋白水平，加速结直肠癌的进展。
为了进一步确定miR-5683与突变型p53的功能，研究人员检测了细胞凋亡和自噬的各种标志物。过表达miR-5683可显著降低Bcl-xl和Bcl-2的表达水平。而抑制miR-5683可增加Bcl-xl和Bcl-2的表达，并阻断对c-caspase 3的诱导作用。尤其是，miR-5683模拟物确实随着LC3II/I的诱导而改变。在SW480细胞中转染RFP-GFP- lc3质粒并给予miR-5683模拟物处理后，观察到GFP降解，RFP/GFP升高，表明自噬被激活。而且，miR-5683过表达抑制突变型p53R273H的产生，而抑制miR-5683则明显促进突变型p53R273H的产生。这些结果表明，miR-5683和CARMN一样，对突变型p53的表达有负反馈作用。这些表明miR-5683抑制p53突变型结直肠癌细胞的进展，并促进细胞凋亡和自噬。
为验证CARMN在体内对结直肠癌生长的影响，研究人员在SW480细胞中敲入载体和CARMN绿色荧光蛋白(GFP)，然后分别接种于裸鼠右侧腋下构建移植瘤模型，SW480/ CARMN过表达组的肿瘤体积明显小于SW480/vector组。研究人员用qRT-PCR分析小鼠组织中p53、CARMN、ALKBH5、FTO和FGF2的表达水平。与对照组相比，过表达CARMN的小鼠异种移植组FGF2、突变型p53和FTO的表达降低。结果表明，在突变型p53存在的情况下，CARMN抑制结直肠癌的体内生长。研究人员还评估了p53、m6A、ALKBH5、FGF2和Ki67在小鼠皮下移植瘤中的水平及其相关性。与对照组相比，过表达CARMN的肿瘤中ALKBH5的表达水平较高，而p53、m6A、FGF2和Ki67的表达水平较低。综上所述，研究结果表明突变型p53在转录水平下调ALKBH5的表达，从而导致CARMN的m6A甲基化水平升高，随后被YTHDF2/3降解。另一方面，CARMN与miR-5683直接相互作用，并通过降解FGF2 mRNA抑制Akt/mTOR通路，诱导凋亡/自噬，对结直肠癌的生长具有协同抑制作用。此外，CARMN和miR-5683对突变型p53的表达具有负反馈作用，而FGF2对突变型p53的表达具有正反馈作用。
CARMN介导体内抗肿瘤作用
研究小结
综上，本研究表明CARMN 缺失与具有突变 p53 的结直肠癌的不良临床病理特征和预后相关。CARMN 过表达可降低结直肠癌细胞的增殖、迁移能力，而 CARMN 敲低则促进突变 p53 的结直肠癌进展。ALKBH5通过m6A-YTHDF2/ ythdf3依赖的方式影响CARMN的去甲基化及其水平的增加。
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