安徽医科大学林宁团队：发现胶质瘤免疫治疗新靶点
7月28日，安徽医科大学林宁研究团队在期刊《Cell Death Discovery》上发表了题为“EZH2–STAT3 signaling pathway regulates GSDMD-mediated pyroptosis in glioblastoma”的研究论文，本研究中，研究人员发现EZH2抑制剂3-Deazaneplanocin A (DZNep)可以诱导GBM细胞焦亡。此外，本研究揭示了信号转导和转录激活因子(STAT3)可以作为受EZH2影响的下游调节因子，影响GBM中的细胞焦亡。DZNep和STAT3抑制剂(SH-4-54)处理后，细胞焦亡相关因子nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3 (NLRP3)和Gasdermin D (GSDMD)水平升高。同时抑制EZH2和STAT3可导致IL-1β和IL-18等炎症因子的表达。综上所述，本研究发现EZH2通过STAT3调控胶质母细胞瘤中的细胞焦亡，而细胞焦亡有可能成为胶质母细胞瘤免疫治疗的靶点。
背景知识
多形性胶质母细胞瘤(GBM)是常见的原发性脑肿瘤，具有生长迅速、侵袭性强、致死率高等特点。目前GBM的治疗以手术为主，辅以放疗和化疗。然而，由于GBM独特的组织结构，肿瘤与正常组织界限不清，术后复发率仍然较高。GBM患者的中位生存期仅为15个月。此外，化疗对GBM的疗效欠佳，血脑屏障的存在影响了GBM的疗效。目前的研究主要集中在揭示GBM的发病机制，诱导GBM中的程序性细胞死亡是主要的研究方向。GBM中凋亡和自噬的研究相对成熟，有多条经过验证的分子通路。然而，对于GBM中细胞焦亡的研究尚处于实验阶段，缺乏相关的分子机制。了解GBM中调控细胞焦亡的分子信号通路，可为胶质瘤患者提供潜在的治疗方向。
细胞焦亡是一种受调控的细胞死亡形式，依赖于Gasdermin蛋白家族，导致膜穿孔。焦亡细胞发生肿胀直至膜破裂，导致细胞内因子外排。在此过程中，IL-1β和IL-18等促炎细胞因子的大量释放，从而引发强烈的炎症反应。在细胞焦亡的经典途径中，Caspase-1裂解Gasdermin D (GSDMD)，产生裂解的n -末端GSDMD (N-GSDMD)。因此，膜孔形成，钾外流，大量炎症因子释放到细胞外空间。这些事件终导致细胞死亡并改变肿瘤微环境。此外，细胞焦亡的激活需要NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 (NLRP3)炎性小体，而NLRP3炎性小体是组装炎性小体的关键分子。炎症小体与Caspase-1结合后，GSDMD被裂解，诱导细胞焦亡。近年来的研究普遍认为，细胞焦亡可直接裂解细胞并诱导免疫细胞浸润，抑制肿瘤生长，在多种细胞生理过程中发挥作用，尤其是在恶性肿瘤的生长中。
DZNep抑制GBM细胞功能并诱导细胞死亡
为了评估EZH2抑制后GBM细胞活力的变化，研究人员用浓度为20 μM的DZNep测定了U87的细胞活力。CCK-8检测显示，DZNep处理后第3天，U87细胞活力显著降低。随后，在菌落形成实验中，DZNep显著降低了U87细胞形成的菌落数量。在U87伤口愈合实验中，研究人员观察到dznep处理组的划痕宽度明显大于对照组。在迁移实验中，dznep处理组的U87细胞通过间隙和基质的迁移能力明显低于对照组。显微镜观察发现DZNep处理后U87细胞呈典型的热噬泡形态。随后的Calcein/PI染色显示DZNep处理后死细胞增多，活细胞显著减少。流式细胞术分析进一步证实，DZNep处理后的部分死亡细胞属于凋亡类型。综上所述，DZNep显著抑制GBM细胞功能，诱导细胞凋亡。
DZNep抑制GBM细胞功能，诱导细胞死亡
EZH2作为STAT3的上游调控因子，通过炎性体调控焦亡
研究人员深入研究了EZH2和STAT3之间的联系，特别关注p-STAT。免疫荧光(IF)染色证实EZH2(绿色)和p-STAT3(红色)在U87中共定位，主要集中在细胞核内。与正常胶质瘤细胞系HA1800相比，定量PCR (qPCR)分析显示，EZH2和STAT3在胶质瘤细胞系U87、H4和A172中表达较高。此外，DZNep处理后，U87和LN229的STAT3总量没有明显变化，而p-STAT3随着剂量的增加而减少。同时，DZNep治疗后炎性小体成分NLRP3蛋白水平升高，在20 μM时显著升高。同样，DZNep处理(20 μM)后，焦亡蛋白GSDMD和N-GSDMD的蛋白水平显著升高。这些发现表明EZH2和STAT3之间存在相互关系，使它们能够调节胶质瘤焦亡。
抑制STAT3激活焦亡并抑制胶质瘤细胞增殖
根据前期研究，EZH2可通过炎性体调控STAT3的磷酸化水平，激活胶质瘤细胞的焦亡。随后，研究人员使用STAT3抑制剂SH-4-54进行干预，SH-4-54 (10 μM)可以抑制p-STAT3蛋白的表达。它还具有提高活化NLRP3、GSDMD和N-GSDMD蛋白表达水平的能力。在光学显微镜下，研究人员观察到SH-4-54处理后的U87细胞有明显的焦亡泡。SH-4-54组U87细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)含量显著升高。用EdU检测胶质瘤细胞系的增殖，SH-4-54可以抑制U87和LN229的增殖。
RO8191逆转sh -4 - 54介导的胶质瘤细胞死亡和焦亡
前期研究表明STAT3作为EZH2的下游靶点，可以调控焦亡。使用STAT3激动剂(ro8191,10 μM)可以逆转sh -4 - 54激活的U87和LN229的焦亡。同时，在显微镜下观察到SH-4-54使U87和LN229失去了原来的细胞形态，而RO8191可以逆转这些形态变化，使细胞恢复到原来的形态。此外，RO8191可以减少SH-4-54引起的细胞死亡，与SH-4-54组相比，RO8191组的死亡细胞明显减少。这些结果表明EZH2通过STAT3调控胶质瘤细胞的凋亡和功能，而RO8191可以逆转这一过程。
研究小结
本研究将EZH2引入胶质瘤焦亡领域。EZH2抑制剂DZNep的使用不仅可以抑制胶质瘤的发生发展，还可以激活胶质瘤焦亡。同时，研究人员证明通过EZH2抑制p-STAT3可增强NLRP3炎性体活性，促进胶质瘤焦亡和炎症因子IL-1β和IL-18的表达。本研究发现为神经胶质瘤焦亡的研究提供了一个潜在的信号通路。
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