中山大学发文：鼻咽癌治疗的潜在靶点
8月8日，中山大学研究团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“ALYREF promotes the metastasis of nasopharyngeal carcinoma by increasing the stability of NOTCH1 mRNA”，在这项研究中，研究人员发现m5C阅读器的Aly/REF输出因子(ALYREF)在鼻咽癌中显著上调，其高表达与转移和不良预后相关。体外和体内研究发现，ALYREF过表达促进鼻咽癌细胞的肿瘤转移。机制上，m5c修饰的NOTCH1 mRNA被确定为ALYREF的靶点。另外，研究人员发现ALYREF以m5C修饰依赖的方式通过增强NOTCH1的RNA稳定性来上调其表达，从而促进NOTCH信号通路的激活，促进鼻咽癌的转移。总之，本研究数据揭示了ALYREF在鼻咽癌转移中的关键作用，并为鼻咽癌提供了一个潜在的治疗靶点。
背景知识
鼻咽癌(NPC)在中国南部、东南亚和北非尤其流行，具有较高的侵袭和转移率。随着鼻咽癌治疗技术的进步，5年局部控制率已达95%。然而，20 ~ 30%的患者在根治性放化疗后仍会发生远处转移。尽管近期有进展，但一旦发生远处转移，预后仍然较差，中位无进展生存期为9.6 ~ 21.4个月。然而，鼻咽癌的转移机制仍不清楚，了解潜在的分子通路对于改善远处转移的控制具有重要意义。
近年来，表观遗传修饰被证实在多种癌症的发生发展中发挥重要作用。5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine, m5C)于20世纪70年代首次被报道，是真核生物mRNA中常见的一种转录后修饰，在mRNA稳定性、翻译效率和核输出等生物学过程中发挥重要作用。一系列调控因子已被证实参与RNA的m5C修饰，包括m5C甲基转移酶(NSUN1-7、DNMT1-2和DNMT3A-B)和去甲基化酶(TET2)。其中，NSUN2和NSUN6是催化哺乳动物mRNA m5C修饰的两种主要甲基转移酶，通过招募解读蛋白如y盒结合蛋白1 (YBX1)和Aly/REF输出因子(ALYREF)发挥其作用。此外，研究人员发现YBX1与AURKA mRNA结合以提高其在鼻咽癌细胞中的蛋白水平。先前的研究表明，ALYREF在促进m5c修饰的mRNA输出方面具有潜在的功能，并且它可能作为肿瘤生长和转移的正调节因子在癌细胞系中发挥作用。然而，ALYREF在NPC中的具体作用尚不清楚。
进化保守的Notch通路在决定肿瘤细胞命运中发挥重要作用。在NOTCH受体家族的4个成员中，NOTCH1因其在肿瘤中的高突变率而被广泛研究。NOTCH1在细胞凋亡、转移、分化和增殖等重要过程中发挥重要作用。在鼻咽癌中，研究人员提出过表达NOTCH1可增强细胞的侵袭和迁移，但其潜在机制尚不清楚。近期的研究表明，Notch信号通路的激活与mettl3介导的m6A (n6 -甲基腺苷)mRNA修饰有关。然而，其他RNA修饰在Notch信号通路中的作用尚不清楚。
ALYREF促进鼻咽癌转移
为了探索ALYREF在鼻咽癌中的功能，研究人员使用siRNA敲低了SUNE1和SUNE2细胞中的ALYREF，之后研究人员进行了RNA测序分析。GSEA结果表明，敲低ALYREF可抑制肿瘤转移相关基因的表达。为了证实这些结果，研究人员在SUNE1和SUNE2细胞中敲低了ALYREF，以及在HK1和hon1细胞中过表达了ALYREF。迁移实验结果显示，敲低ALYREF可显著抑制SUNE1和SUNE2细胞的侵袭和迁移能力。相反，在HK1和hon1细胞中过表达ALYREF可增加其侵袭和迁移能力。另外，研究人员通过CCK-8实验检测ALYREF敲低和过表达对鼻咽癌细胞增殖的影响。数据显示，与相应的对照细胞相比，ALYREF敲低和过表达细胞的细胞活力没有显著改变，表明ALYREF促进鼻咽癌转移不是由于对细胞增殖的影响。除此之外，研究人员利用裸鼠肺转移模型来研究ALYREF在体内的功能。研究人员观察到，与载体对照组相比，ALYREF过表达组的荧光素酶信号更强，转移性肺结节更多，表明ALYREF过表达促进了HONE1细胞的肺转移。综上所述，这些结果揭示了ALYREF在促进鼻咽癌转移中的关键作用。
ALYREF促进鼻咽癌细胞的侵袭和转移
ALYREF通过激活NOTCH1信号通路发挥其致癌作用
为了研究ALYREF促进鼻咽癌转移的分子机制，研究人员对RNA-Seq数据进行了GSEA分析，结果显示ALYREF与Notch信号通路呈正相关。由于NOTCH1先前被发现可以促进鼻咽癌的转移，研究人员假设ALYREF可能通过激活Notch信号通路发挥其作用。然后，研究人员在ALYREF过表达的HONE1细胞和载体对照细胞中进行了Flag-RIP检测。研究人员发现，在hon1细胞中，ALYREF的过表达增加了NOTCH1的蛋白和mRNA水平。相反，敲低ALYREF可抑制SUNE1细胞中NOTCH1蛋白和mRNA的表达。此外，qRT-PCR和蛋白质免疫印迹实验结果显示，ALYREF敲低后，Notch信号通路的下游靶基因HES1和HEY1在SUNE1细胞中被显著抑制。研究人员通过组织学染色验证了转移性肺异种移植的存在，并证实了在ALYREF过表达的荷瘤小鼠中，与对照条件相比，NOTCH1蛋白水平升高。为了确定NOTCH1抑制是否可以逆转ALYREF的表型，研究人员用50 mg/L的新型r-分泌酶抑制剂LY3039478来阻断NOTCH1信号通路。LY3039478处理后，过表达ALYREF的HONE1细胞的侵袭和迁移能力明显减弱。综上所述，这些结果表明，ALYREF通过激活Notch信号通路促进鼻咽癌转移。
研究小结
综上所述，本研究结果确定了ALYREF是鼻咽癌中一种新的致癌基因。研究发现，ALYREF的上调与鼻咽癌患者的转移和不良预后有关。在鼻咽癌细胞中，ALYREF通过m5c依赖的方式激活NOTCH1来促进转移。重要的是，本研究结果强调了ALYREF作为使用LY3039478治疗鼻咽癌的潜在生物标志物和治疗靶点。
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