8月8日，上海交通大学研究团队在期刊《Advanced Science》上发表了研究论文，题为“PTBP3 Mediates IL-18 Exon Skipping to Promote Immune Escape in Gallbladder Cancer”，本研究中，研究人员结合GEO数据库和GBC mRNA-seq分析，发现剪接因子聚嘧啶区域结合蛋白3 (PTBP3)在GBC中高表达。多组学分析显示，PTBP3促进了白细胞介素-18 (IL-18)的外显子跳跃，导致ΔIL-18的表达，这是一种肿瘤特异性表达的亚型。ΔIL-18通过下调CD8+T细胞中FBXO38的转录水平来减少PD-1泛素介导的降解，从而促进GBC免疫逃逸。通过HuPBMC小鼠模型，研究人员证实了PTBP3和ΔIL-18在促进GBC生长中的作用，并表明阻断ΔIL-18产生的反义寡核苷酸显示出抗肿瘤活性。此外，H3K36me3通过MRG15募集PTBP3促进IL-18外显子跳跃，从而耦合IL-18转录和选择性剪接过程。特别是，研究还发现H3K36甲基转移酶SETD2与hnRNPL结合，从而干扰PTBP3与IL-18前体mRNA的结合。总的来说，本研究为异常的选择性剪接机制如何影响免疫逃逸提供了新的见解，并为改善GBC免疫治疗提供了潜在的新视角。
背景知识
胆囊癌虽然是胆道系统的高度恶性肿瘤，但由于缺乏典型的临床症状和早期诊断工具，往往诊断较晚。目前胆囊癌手术切除是公认的治疗方法，但能够进行手术治疗的患者很少，各种辅助治疗方式的疗效有限。因此，有必要更深入地阐明胆囊癌的发病机制，寻找有效的治疗靶点。
在高等真核生物中，遗传信息从DNA到成熟mRNA的传递通常需要前体mRNA的剪接。大多数含有内含子的基因经历简单的内含子剪接和外显子连接，这一过程被称为组成性剪接。选择性剪接提供了额外的基因调控模式，可以显著增加转录本数量，增强蛋白质的结构和功能多样性。虽然许多蛋白质的不同剪接亚型在正常条件下是有益的，但在病理条件下的选择性剪接可能会导致有害影响。例如，在肿瘤组织中，广泛的选择性剪接异常已被证明有助于肿瘤进展。选择性剪接主要有5种方式，其中外显子跳跃是常见的。选择性剪接相关rna结合蛋白(RBPs)在肿瘤发生过程中调节选择性剪接事件中发挥重要作用。例如，DDX17可调节选择性剪接产生促肝癌转移的PXN-AS1致癌亚型。此外，之前的研究表明，一个不含POU结构域的八聚体结合蛋白通过增强DLG1的致癌RNA剪接促进胆囊癌细胞增殖。然而，研究人员对胆囊癌中选择性剪接异常的认识还远远不够。
PTBP3通过ΔIL-18促进胆囊癌免疫逃逸
基于12例胆囊癌患者的mRNA-seq数据，研究人员采用Spearman分析探讨PTBP3与免疫细胞浸润的关系。如图1A所示，NK细胞和CD8+T细胞与PTBP3表达呈显著负相关。CD8+T细胞是参与肿瘤发生、发展的重要免疫细胞，在肿瘤细胞免疫逃逸中发挥重要作用。PTBP3的表达与CD8+T细胞浸润呈负相关，而IL-18 PSI值与CD8+T细胞浸润呈正相关。基于这些结果，研究人员使用了肿瘤细胞和CD8+T细胞共培养系统，表明在肿瘤细胞中PTBP3敲低增强了CD8+T细胞的抗肿瘤作用。ELISA检测结果显示，与敲低PTBP3的NOZ和ZJU-0430细胞共培养后，CD8+T细胞产生更多的颗粒酶B和IFNγ。免疫检查点的失调在许多恶性肿瘤的免疫逃避中起着重要作用。其中，PD-1 /PD-L1轴的破坏被证明与肿瘤进展显著相关。mRNA-seq分析结果显示，在12例配对的胆囊癌标本中，PTBP3与PD-L1的表达无显著相关性，但与PD-1的表达呈正相关。蛋白质免疫印迹实验结果显示，在CD8+T细胞共培养体系中，敲低胆囊癌细胞PTBP3对PD-L1的表达无明显影响，但显著降低了CD8+T细胞中PD-1的表达。接下来，研究人员构建了HuPBMC小鼠模型，在体内研究PTBP3在胆囊CD8+T细胞抗肿瘤功能和免疫治疗敏感性中的作用。通过流式细胞术对HuPBMC小鼠模型进行验证，证实小鼠体内人CD45+细胞的百分比大于60%。体内实验表明，通过皮下肿瘤体积和质量测量，PTBP3敲低显著抑制HuPBMC肿瘤生长，并提高胆囊癌免疫治疗的敏感性。此外，研究人员对皮下肿瘤进行了mIHC，发现在PTBP3敲低组中浸润的CD8+T细胞比对照组更多。相反，在NOG小鼠皮下肿瘤模型中，PTBP3敲低后对肿瘤生长没有显著影响，表明PTBP3敲低介导的抗肿瘤效应是CD8+T细胞依赖的。
图1：PTBP3通过ΔIL-18促进胆囊癌免疫逃逸
为了研究PTBP3是否通过ΔIL-18介导胆囊癌免疫逃逸，研究人员在肿瘤细胞中过表达PTBP3，并用ASO4处理肿瘤细胞以减少ΔIL-18的产生。流式细胞术分析显示，ASO4部分逆转了PTBP3过表达引起的细胞凋亡抑制。ELISA检测结果也表明ASO处理能够挽救PTBP3过表达导致的CD8+ T细胞颗粒酶B和IFNγ分泌的减少。此外，蛋白质免疫印迹实验显示ASO4处理降低了CD8+T细胞中PD-1的表达，也降低了PTBP3诱导的PD-1表达的增加。使用HuPBMC小鼠模型进行的体内实验也证实，ASO4可减少PTBP3过表达引起的肿瘤进展，并显示出显著的抗肿瘤作用。mIHC结果显示，ASO4治疗增加了CD8+T细胞在肿瘤内的浸润，与CD8+T细胞的抗肿瘤作用相一致。在药物安全性方面，ASO4处理的小鼠主要脏器(心、肝、肾、肺)未见明显病理改变。综上所述，ptbp3介导的促肿瘤作用是CD8+T细胞依赖的，ASO4可能在胆囊癌的治疗中具有潜在价值。
研究小结
综上所述，研究人员发现剪接因子PTBP3在胆囊癌中表达显著上调，并与胆囊癌患者的预后相关。PTBP3对胆囊癌细胞的生物学行为无明显影响，但通过促进IL-18外显子跳跃促进肿瘤细胞的免疫逃逸。在机制上，通过外显子跳跃产生的ΔIL-18通过降低FBXO38转录水平，减少了CD8+T细胞中PD-1泛素介导的降解。在选择性剪接调控过程中，H3K36me3通过MRG15招募PTBP3促进外显子跳跃，并偶联IL-18转录和选择性剪接。同时，hnRNPL通过SHI结构域与SETD2结合，通过抑制PTBP3与IL-18前体mRNA的结合来损害IL-18外显子跳跃。本研究加深了对胆囊癌进展过程中异常选择性剪接事件的认识，并为胆囊癌的免疫治疗提供了新的治疗靶点。
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