温州医科大学苏志鹏团队：发现胶质瘤患者治疗新策略
8月19日，温州医科大学苏志鹏研究团队在期刊《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上发表了研究论文，题为“SelK promotes glioblastoma cell proliferation by inhibiting β-TrCP1 mediated ubiquitin-dependent degradation of CDK4”，本研究中，研究人员发现与长期存活者(≥3年)相比，SelK在短期存活者(≤1年)的GB样本中显著上调，且其表达水平与临床预后呈负相关。抑制SelK表达降低裸鼠GB细胞活力，诱导G0/G1期阻滞，损害移植胶质瘤细胞的生长。Selk诱导的内质网应激下调导致SKP2表达降低，β-TrCP1表达上调。上调β-TrCP1，从而加速泛素依赖性CDK4的降解，终抑制GB细胞的恶性增殖。
背景知识
胶质母细胞瘤(GB)是中枢神经系统致命、顽固的恶性实体肿瘤之一。尽管外科、药物和放疗治疗取得了进展，但GB患者的预后仍然极差，中位生存期为14.6个月，1、2、3和5年生存率分别仅为39.3%、16.9%、9.9%和5.5%。少数存活≥3年的GB患者被称为长期生存者(long-term survivors, LTS)。在研究当前治疗产生持久疗效的能力的决定因素时，这一患者群体仍然很重要。
靶向治疗正在成为改善GB患者预后的可行治疗选择。研究表明，贝伐珠单抗(VEGF抑制剂)和达可替尼(EGFR抑制剂)在临床实践中显示出前景。然而，GB是一种高度异质性的肿瘤，单靶点治疗的疗效有限。因此，识别多个靶点，采用多模式联合治疗是GB治疗的未来。因此，迫切需要探索靶向肿瘤细胞的新的、高度特异的治疗靶点，以提高当前治疗的敏感性，为GB患者的长期获益提供更多希望。
肿瘤细胞的恶性增殖是对患者健康产生负面影响的关键因素。尽管研究取得了进展，发现了许多基因和蛋白质的异常，但信号转导通路的失调和细胞周期控制的丧失仍然是GB的突出问题。多项研究表明，减小肿瘤组织体积和抑制肿瘤细胞增殖既可以缓解神经症状，又可以优化放化疗的疗效。
SelK在人GB细胞株中表达上调，敲低SelK表达可抑制GB细胞的生长
研究人员通过蛋白质免疫印迹实验检测了SelK在人正常星形胶质细胞(NHA)和不同人GB细胞系中的表达，探讨了SelK在GB发育中的潜在作用。SelK在人GB细胞株中的表达高于NHA细胞。研究人员通过光密度分析进一步证实了SelK的表达水平明显升高，尤其是在LN229和U251细胞株中。随后，在LN229和U251细胞中使用shRNA敲低SelK，构建稳定敲低SelK的细胞株。研究人员还通过蛋白质免疫印迹实验验证了敲低效果，并选择shSelK#1和shSelK#2来研究SelK在GB发育中的作用。通过ATP实验、软琼脂实验、平板克隆形成实验和EdU实验评估SelK对细胞增殖和肿瘤生长的潜在作用。结果表明，敲低SelK可显著抑制GB细胞的恶性增殖能力。实验结果还表明，SelK过表达显著促进GB细胞的恶性增殖。这些结果表明，SelK可能在GB细胞的体外发育中发挥关键作用。
SelK在人GB细胞株中表达上调，敲低SelK表达可抑制GB细胞的生长
敲低SelK显著抑制体内胶质母细胞瘤细胞的恶性增殖能力
为了评估SelK对GB体内增殖能力的影响，研究人员将SelK敲低细胞LN229、U251或非义控制细胞通过皮下注射注入BALB/c-裸鼠体内，建立异种移植肿瘤模型。28天后，评估小鼠及其肿瘤的生长和体积。分析表明，体内敲低SelK显著抑制了LN229和U251细胞的增殖能力，表现为肿瘤体积和重量的减少。同时分析肿瘤中增殖标记物Ki67（IHC）的蛋白表达水平，研究人员发现来自SelK敲低细胞的肿瘤组织中SelK和Ki67的蛋白表达水平显著降低。这些结果表明，体内敲低SelK可能抑制GB细胞的增殖能力。
上调SKP2表达并促进SKP2介导的β-TrCP1泛素化
上述结果表明，β-TrCP1在GB细胞的生长中起着关键作用，在SelK的影响下，它是CDK4的关键调节因子。此外，定量PCR分析显示，SelK主要在蛋白质水平上调节β-TrCP1，因为在敲除SelK的GB细胞中，β-TrCP1的转录水平没有明显变化。
为了进一步探究SelK对GB细胞生长进程的影响，研究人员进行了蛋白质降解实验，以评估SelK对β-TrCP1稳定性的影响。实验结果表明，与对照组细胞相比，SelK敲除细胞中的β-TrCP1更稳定，这表明SelK抑制了β-TrCP1的降解速率。研究人员还评估了SelK敲除GB细胞中SKP2和SMURF2的表达。数据显示，SMURF2蛋白水平没有明显变化，而SKP2水平在上述细胞中持续下调。因此，这些数据表明SelK可能通过增加SKP2蛋白水平和降低β-TrCP1表达来促进CDK4蛋白表达。
为了研究SKP2与β-TrCP1之间的相互作用，并确定SelK介导的SKP2调节是否影响恶性GB细胞的增殖，在LN229细胞和稳定细胞系中过表达SKP2。有趣的是，在SKP2过表达的SelK敲除细胞中，β-TrCP1蛋白水平降低。进一步分析显示，与对照细胞相比，SKP2过表达导致LN229细胞的增殖增加，无论是在ATP或软琼脂培养基中均是如此。蛋白质降解实验表明，在SelK敲除和SKP2过表达的细胞中，β-TrCP1蛋白降解速度高于对照细胞。此外，蛋白质降解实验还表明，在SelK敲除和SKP2过表达的细胞中，CDK4比对照细胞更稳定。综上所述，这些结果共同表明，SelK通过增加SKP2的蛋白质水平来增强β-TrCP1的泛素化，导致β-TrCP1蛋白表达降低和CDK4蛋白表达增加，终促进GB细胞增殖。
研究小结
总之，本研究证明了SelK/内质网应激/SKP2/β-TrCP1/CDK4轴在GB增殖中的重要作用。从这些发现来看，可以清楚地看出SelK是GB细胞发育和/或维持过程中的一个重要致癌分子。因此，开发能够靶向SelK及其下游效应物的小分子抑制剂或激动剂，可能会有助于指导GB患者的治疗策略。
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