浙江大学周天华/谢珊珊团队：揭示胃癌抑制新机制
8月23日，浙江大学周天华/谢珊珊研究团队在期刊《Clinical And Translational Medicine》上发表了研究论文，题为“PUS7-dependent pseudouridylation of ALKBH3 mRNA inhibits gastric cancer progression”，本研究结果表明，与癌旁组织相比，PUS7在胃癌组织中显著降低。功能分析表明，PUS7通过其催化活性抑制胃癌细胞增殖和肿瘤生长。此外，PUS7通过假尿苷修饰U696位点来提高ALKBH3 mRNA的翻译效率，从而抑制肿瘤生长。重要的是，ALKBH3在胃癌中具有肿瘤抑制作用，其表达与肿瘤组织中PUS7的水平密切相关。这些发现突显了mRNA假尿苷化在癌症生物学中的潜在重要性，并为胃癌治疗提供了一个潜在靶点。
背景知识
假尿苷化是RNA中常见的修饰之一，在多种细胞过程中发挥着不可或缺的作用。RNA假尿苷化可以增强碱基堆积，改善碱基配对，并使糖磷酸骨架变得坚硬，从而导致RNA结构发生改变，调节基因表达。之前的研究主要关注tRNAs、rRNAs和snRNAs中的假尿苷（Ψ）位点，这些位点含量丰富，因此更容易通过生化方法进行鉴定。rRNAs和tRNAs中假尿苷沉积的失调已被与多种生物学过程联系在一起，包括肿瘤发生。近期在mRNA上广泛定位假尿苷的进展揭示了其在mRNA靶标中的存在。然而，mRNA假尿苷化的生物学功能仍然鲜为人知。
假尿苷化是由尿苷(U)的特异性异构化反应催化，由假尿苷合成酶(PUS)所介导。PUS酶被分为六类：TruA、TruB、TruD、RsuA、RluA和Pus10。其中，PUS7是唯一已知的TruD家族成员。PUS7介导的Ψ修饰参与各种生物学过程，包括癌症发生，通过修饰Ψ来修饰tRNAs。PUS7的失活会损害胚胎干细胞中由tRF介导的翻译调节，导致蛋白质合成增加和胚层分化缺陷。PUS7已被证实通过PUS7依赖的tRNA修饰促进胶质母细胞瘤干细胞的肿瘤发生。PUS7还通过上调LASP1(LIM和SH3蛋白1)促进结直肠癌细胞的转移，而与PUS7的催化活性无关。近期的研究发现，PUS7可以在哺乳动物细胞的mRNA上进行假尿苷化修饰。尽管如此，PUS7介导的mRNA假尿苷化功能仍不清楚。
PUS7通过其Ψ合酶活性抑制胃癌细胞增殖
为了确定PUS7在胃癌发生中的作用，研究人员首先检测了人胃癌细胞株中PUS7蛋白的水平。结果表明，PUS7在MKN45细胞中高表达，而在AGS细胞中低表达。由于三维(3D)细胞培养比二维培养在生物学上与生物体更相关，研究人员使用3D集落形成实验检测PUS7对胃癌细胞增殖的影响。数据显示，用短发夹rna (shrna)敲除PUS7显著增加MKN45细胞的集落形成能力。挽救实验显示，PUS7的异位表达显著减弱了增强的MKN45细胞增殖能力。进一步的迁移和侵袭实验显示，敲除PUS7后，MKN45细胞的迁移和侵袭能力显著增加。同时，过表达PUS7可恢复PUS7缺陷细胞增加的迁移和侵袭表型。PUS7作为抑癌基因抑制胃癌的增殖、迁移和侵袭。
为了研究PUS7在胃癌细胞生长中的作用是否依赖于其Ψ合酶活性，研究人员构建了一个催化失活的PUS7突变体(PUS7- d294a)。在PUS7敲除的细胞中，野生型PUS7的异位表达显著恢复了细胞的增殖表型，而突变型PUS7的异位表达则不能。此外，过表达野生型PUS7可显著降低AGS细胞的集落数，而突变型PUS7- d294a对AGS细胞的增殖无明显影响。更重要的是，在裸鼠皮下种植实验中，野生型PUS7的过表达显著抑制了AGS细胞的成瘤性，而突变型PUS7- d294a的过表达并没有显著抑制AGS细胞的成瘤性。综上所述，这些发现表明，PUS7抑制胃癌细胞的增殖和肿瘤生长，这依赖于其催化活性。
PUS7通过ALKBH3抑制胃癌生长
鉴于PUS7能够抑制胃肿瘤的生长并使ALKBH3 mRNA假尿苷化，因此可以合理地推测ALKBH3可能参与了PUS7在胃癌发生中的调节作用。3D克隆形成、迁移和侵袭实验表明，ALKBH3的缺失显著增强了MKN45细胞的增殖、迁移和侵袭能力，这一现象在过表达ALKBH3后显著逆转。敲除ALKBH3的表型与ALKBH3-缺失细胞的表型相似。此外，过表达ALKBH3显著抑制了AGS细胞的增殖。当研究人员将MKN45细胞皮下注射到裸鼠体内时，生物发光成像（BLI）实验显示，ALKBH3敲低显著增加了对照细胞的BLI信号。ALKBH3缺失还导致皮下肿瘤体积和重量的显著增加。此外，ALKBH3过表达在异种移植小鼠模型中显著抑制了胃肿瘤的生长。综上所述，这些结果表明ALKBH3在胃癌中起着肿瘤抑制基因的作用。
ALKBH3抑制胃癌细胞增殖和肿瘤生长
接下来，研究人员进行了挽救实验，以阐明ALKBH3是否介导了PUS7在胃癌发生中的功能。数据表明，ALKBH3的异位表达显著抑制了PUS7敲除诱导的MKN45细胞增殖表型。裸鼠移植瘤模型的BLI实验显示，敲除PUS7的MKN45细胞的BLI信号也增加，而这种增加被ALKBH3或PUS7的异位表达显著逆转。通过外源性表达ALKBH3或PUS7，去除PUS7的MKN45细胞的肉眼皮下肿瘤明显减少。综上所述，这些发现表明PUS7通过ALKBH3抑制胃癌生长。
胃癌组织中PUS7和ALKBH3的表达显著相关
为了评估PUS7和ALKBH3表达的临床相关性，研究人员首先检测了ALKBH3蛋白在人胃癌组织及其配对的非肿瘤组织中的水平。组织芯片的免疫组化分析显示，队列1的胃癌组织中ALKBH3的表达显著降低。蛋白质免疫印迹实验证实，与队列2中相应组织相比，胃癌组织中ALKBH3蛋白显著降低。此外，研究人员仔细分析了胃癌组织中PUS7和ALKBH3表达的相关性，发现在两个队列的胃癌组织中，PUS7和ALKBH3水平显著相关。
研究小结
本研究表明，PUS7和ALKBH3在胃癌组织中的表达水平显著降低。PUS7通过其Ψ催化活性抑制胃癌细胞的增殖和肿瘤生长。重要的是，PUS7通过假尿苷(Ψ)修饰ALKBH3 mRNA，提高其翻译效率，从而抑制胃癌的生长。这些发现阐明了ALKBH3 mRNA的PUS7依赖性假尿苷基化在阻止胃癌发生中的关键作用。
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