金铁峰/张美花团队：潜在的乳腺癌生物标志物和治疗靶点
8月28日，延边大学金铁峰/张美花研究团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“LncRNA HAGLROS promotes breast cancer evolution through miR-135b-3p/COL10A1 axis and exosome-mediated macrophage M2 polarization”，本研究中，研究人员发现lncRNA HAGLROS在乳腺癌组织和血浆外泌体中高度表达，其高表达与乳腺癌患者的不良预后有关。功能上，乳腺癌细胞来源的外泌体lncRNA HAGLROS通过诱导TAM/M2极化促进乳腺癌细胞增殖、迁移、上皮间质转化（EMT）过程和血管生成。机制上，lncRNA HAGLROS与miR-135-3p竞争结合，防止其靶基因COL10A1的降解。总之，这些结果表明lncRNA HAGLROS/miR-135b-3p/COL10A1轴促进乳腺癌进展，揭示了乳腺癌细胞与TAM之间的交互通讯机制，表明lncRNA HAGLROS可能是乳腺癌的潜在生物标志物和治疗靶点。
背景知识
乳腺癌是女性常见的癌症，也是女性癌症死亡的主要原因。根据新的全球癌症统计数据，2020年，女性乳腺癌的发病率已超过肺癌，成为全球范围内常见的癌症类型。在女性中，乳腺癌在发病率和死亡率方面均排名第一，对女性的健康构成了严重威胁。尽管在不同亚型乳腺癌的早期诊断和治疗方面取得了进展，但晚期和转移性乳腺癌患者的预后仍然不佳。因此，寻找有效的生物标志物对于乳腺癌患者的治疗具有重要的临床意义。
人类基因组中只有不到2%的部分被转录为编码RNA，而超过98%的部分被转录为非编码RNA（ncRNA），这表明人类基因组中储存了大量ncRNAs。lncRNA是一种长度超过200个核苷酸的ncRNA，由于缺乏有效的开放阅读框（ORF）而不具备编码蛋白质的能力。一些研究发现，异常表达的lncRNA与多种肿瘤的发生密切相关。miRNA是一种内源性的非编码单链小RNA，长度约为18-22个核苷酸，广泛存在于真核生物中，它通过碱基互补配对与mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）结合，在转录后水平促进靶mRNA的降解或翻译抑制，从而影响肿瘤的进展。研究表明，lncRNA通过多种机制影响肿瘤的进展，作为竞争性内源性RNA（ceRNA）与miRNA竞争性结合以影响mRNA表达是当前研究的热点话题。lncRNA HCG18通过吸附miR-29a/b来上调TRAF4/TRAF5表达，从而促进上皮性卵巢癌的增殖、迁移和EMT过程。然而，大多数在乳腺癌中异常表达的lncRNA作为ceRNA的功能和机制尚不清楚。
乳腺癌细胞来源的lncRNA HAGLROS通过p-STAT3信号通路诱导TAM/M2极化
为了探究lncRNA HAGLROS与乳腺癌微环境之间的潜在机制，研究人员从乳腺癌细胞培养上清液中分离出外泌体进行验证。qRT-PCR结果显示，与乳腺上皮细胞外泌体相比，乳腺癌细胞外泌体中lncRNA HAGLROS的表达显著升高。透射电子显微镜观察到外泌体直径约为100 nm，呈碟形结构。NTA结果显示外泌体粒子直径为126.8 nm。蛋白质免疫印迹实验结果显示，来自乳腺癌细胞的外泌体上表达有外泌体标记物TSG101和CD9。为了明确lncRNA HAGLROS是否能包裹在外泌体中，研究人员从表达lncRNA HAGLROS不同的乳腺癌细胞培养上清液中提取外泌体。qRT-PCR结果显示，与对照组相比，过表达lncRNA HAGLROS的外泌体中lncRNA HAGLROS的表达显著上调，反之亦然。这些结果表明lncRNA HAGLROS被包裹在外泌体中。为了探究外泌体是否能够被巨噬细胞摄取并调节TAMs极化，将PKH26标记的外泌体（10 μg/mL）与THP-1细胞共孵育，荧光显微镜观察显示PKH26标记的外泌体能够被THP-1细胞摄取。随后，将THP-1细胞与表达lncRNA HAGLROS的乳腺癌细胞来源的外泌体共培养。qRT-PCR、蛋白质免疫印迹实验和流式细胞术结果显示，表达lncRNA HAGLROS的外泌体显著下调TAM/M1标志物（CD86和iNOS）的表达水平，同时上调lncRNA HAGLROS和TAM/M2标志物（CD206、CD163、Arg-1）的表达水平，反之亦然。为了进一步验证体外实验的结果，研究人员收集了乳腺癌患者的血浆外泌体和乳腺癌组织进行qRT-PCR和IHC实验，结果显示，乳腺癌血浆外泌体中lncRNA HAGLROS的表达水平高于健康个体血浆外泌体，而乳腺癌组织中CD86的表达水平低于癌旁组织，CD206的表达则相反。这些结果表明，来自乳腺癌细胞的外泌体lncRNA HAGLROS抑制TAM/M1极化并促进TAM/M2极化。
外泌体lncRNA HAGLROS促进TAM/M2极化
为了进一步探究外泌体lncRNA HAGLROS调控TAM/M2极化的分子机制，研究人员研究了与免疫相关的信号通路，包括CEBPβ、MAPK和STAT信号通路，它们都参与TAM/M2极化。蛋白质免疫印迹实验结果显示，外泌体lncRNA HAGLROS对p-ERK、p-STAT6和CEBPβ的蛋白表达水平没有影响。然而，在高表达lncRNA HAGLROS的外泌体处理后，p-STAT3的表达水平显著上调。随后，用不同浓度的STAT3抑制剂和激动剂处理巨噬细胞。通过蛋白质免疫印迹实验检测pSTAT3和STAT3的表达，并筛选出0.8 μM的STAT3抑制剂和4 nM的激动剂用于后续实验。蛋白质免疫印迹实验结果显示，STAT3抑制剂恢复了外泌体lncRNA HAGLROS上调所促进的TAM/M2相关标志物的表达，反之亦然。这些结果表明，乳腺癌细胞来源的外泌体lncRNA HAGLROS通过激活p-STAT3信号通路促进TAM/M2极化。
研究小结
综上，lncRNA HAGLROS在乳腺癌中高度表达，并预测患者预后不良，促进乳腺癌细胞的生物学行为。lncRNA HAGLROS通过靶向miR-135b-3p/COL10A1轴促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化过程和血管生成。同时，乳腺癌细胞来源的外泌体lncRNA HAGLROS通过p-STAT3途径诱导TAM/M2极化，增强乳腺癌细胞的恶性演变。这项研究阐明了lncRNA HAGLROS/miR-135b-3p/COL10A1信号通路与乳腺癌发展密切相关，外泌体在乳腺癌TME中发挥重要作用，通过传递lncRNA HAGLROS成为乳腺癌诊断和预后的新型分子标志物，并为乳腺癌靶向治疗提供了新的靶点。
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