西安交通大学赵茜茜/马红兵团队发文：食管鳞癌的潜在治疗靶点
10月5日，西安交通大学赵茜茜/马红兵研究团队在期刊《Clinical And Translational Medicine》上发表了研究论文，题为“N6-methyladenosine-mediated upregulation of LNCAROD confers radioresistance in esophageal squamous cell carcinoma through stabilizing PARP1”，本研究中，研究人员发现LNCAROD是一种新的mettl3介导的lncRNA，可以增强ESCC细胞的辐射抗性，并被YTHDC1转录后稳定。LNCAROD通过促进PARP1- npm1相互作用，阻止PARP1蛋白的泛素-蛋白酶体降解，从而促进同源重组介导的DNA双链断裂修复，增强食管鳞癌细胞的辐射抗性。在裸鼠ESCC模型中沉默LNCAROD会减缓肿瘤生长并增加放射敏感性。
背景介绍
食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，死亡率居世界第六位，发病率居世界第七位。食管癌的主要病理亚型包括食管腺癌和食管鳞状细胞癌(ESCC)，其中ESCC约占我国组织学分类的90%。由于食管鳞癌起病隐匿，生长迅速，大多数患者就诊时已处于晚期，放疗是其主要治疗手段。尽管放疗技术取得了显著进步，但仍有相当比例的患者因放疗抵抗而出现局部复发，患者的5年生存率仍低于30%。因此，明确食管鳞癌辐射抗性的分子机制，为优化放射增敏治疗提供新的思路势在必行。
n6 -甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是真核细胞转录后阶段的一种常见修饰，对RNA的稳定性、选择性剪接、亚细胞定位和翻译效率有重要影响。RNAs的m6A修饰主要由METTL3、METTL14和WTAP组成的m6A甲基转移酶复合物沉积，并被ALKBH5和FTO等m6A去甲基化酶逆转，维持其动态平衡。m6A修饰由m6A阅读器蛋白检测，包括YTHDC1/2、IGF2BP1/2/3等，执行相应的调控功能。越来越多的证据表明，m6A修饰可以影响参与DNA修复通路的基因的表达和功能，从而影响电离辐射(IR)损伤后的修复效率。到目前为止，大多数关于肿瘤辐射抗性的研究主要集中在m6A修饰对mRNA的影响。m6A修饰调控长链非编码RNA(lncrna)在食管鳞癌辐射抗性中的确切机制仍不清楚。
LNCAROD可增强食管鳞癌细胞的辐射抗性
研究人员评估了LNCAROD在KYSE-150和KYSE-150R细胞中的表达，发现LNCAROD在KYSE-150R细胞中表达上调。为研究短期辐射暴露对LNCAROD的影响，研究人员检测了不同剂量辐射处理食管鳞癌细胞后LNCAROD的表达。RT-qPCR和FISH结果证实LNCAROD的表达随着辐射剂量的增加而显著增加。这些发现表明LNCAROD可能是获得和维持辐射抗性所必需的。此外，8 Gy照射后KYSE-150细胞中METTL3的表达上调，而YTHDC1的表达无明显变化。沉默METTL3导致LNCAROD表达降低，阻碍了辐射诱导的LNCAROD水平升高。与KYSE-150细胞相比，KYSE-150R细胞中LNCAROD的m6A水平显著升高。综上所述，辐射诱导的LNCAROD表达上调是由于METTL3增加了LNCAROD的m6A修饰水平。
LNCAROD受METTL3调控影响食管鳞癌细胞的辐射抗性
随后，研究人员通过反义寡核苷酸(ASOs)抑制了相对高水平LNCAROD的KYSE-150和TE-1细胞中LNCAROD的表达，发现照射后LNCAROD缺陷细胞的凋亡水平显著增加。在细胞周期分布方面，沉默LCNAROD联合照射使更多的食管鳞癌细胞被阻滞在G2/M期。研究人员利用CRISPR-Cas9技术获得稳定敲除LNCAROD的ESCC细胞并进行克隆形成实验。在食管鳞癌细胞中敲除LNCAROD后，照射后细胞增殖和克隆形成能力受到抑制。γH2AX检测常用于DNA损伤和双链断裂(DSB)的鉴定，可用于评估DSB损伤和修复水平。γH2AX焦点形成检测结果显示，敲除LNCAROD基因的食管鳞癌细胞DNA损伤后5 h和24 h， γH2AX阳性细胞百分比明显升高。综上所述，这些结果表明LNCAROD减轻了辐射诱导的DNA损伤，增强了食管鳞癌细胞的辐射抗性。
PARP1过表达抵消了LNCAROD敲除带来的放射增敏作用
研究人员进一步评估了LNCAROD在食管鳞癌细胞中的放射抵抗作用是否由PARP1介导。首先，重新引入过表达PARP1的质粒导致LNCAROD沉默的ESCC细胞中PARP1的蛋白水平升高。其次，研究人员进行了彗星实验，发现与对照组细胞相比，LNCAROD敲除细胞在辐射后24 h内尾矩显著延长，表明DNA损伤增加。此外，过表达PARP1有效逆转了LNCAROD缺陷对辐射诱导的DNA损伤的影响，表明LNCAROD通过调控PARP1减轻辐射诱导的DNA损伤。免疫荧光染色结果显示，敲除LNCAROD后，辐射诱导的γH2AX灶形成显著增加，而引入外源性PARP1表达可有效抵消这一作用。
克隆形成实验结果表明，上调PARP1表达可有效挽救照射后LNCAROD缺失细胞的存活比例，从而抵消LNCAROD缺失引起的放射增敏作用。此外，流式细胞术分析显示，沉默LNCAROD显著增强了辐射诱导的细胞凋亡水平，而上调PARP1则减弱了LNCAROD敲除所产生的促凋亡作用。细胞周期实验结果显示，过表达PARP1显著抑制LNCAROD敲除细胞照射后G2/M期比例的增加。综上所述，这些发现表明LNCAROD沉默降低了食管鳞癌细胞的辐射抗性，而PARP1过表达逆转了这种损害。
结论
综上所述，本研究表明m6a修饰的LNCAROD通过稳定PARP1而增加食管鳞状细胞癌的辐射抗性，从而为缓解辐射抵抗提供了新的视角和线索。
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