华中科技大学黄文杰团队：发现靶向肝癌转移的新策略
近日，华中科技大学黄文杰研究团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“GPR56 facilitates hepatocellular carcinoma metastasis by promoting the TGF-β signaling pathway”，本研究揭示了GPR56在人类肝癌病例中的表达水平显著升高，且升高的GPR56水平与不良预后相关。GPR56通过与TGFBR1相互作用调控TGF-β通路，从而促进HCC转移。同时，GPR56受TGF-β信号的典型级联调节，从而建立正反馈回路。此外，联合应用TGFBR1抑制剂GAL和GPR56抑制剂DHM显著抑制肝癌转移。靶向该信号通路的干预有望有效阻止GPR56介导的肝癌转移。
背景介绍
HCC是一种常见的恶性肿瘤，在全球癌症相关死亡中排名第三。由于在疾病晚期发现延迟、肿瘤频繁转移和手术切除后肿瘤复发，死亡率升高。尽管近几十年来取得了显著进展，但晚期HCC患者的预后仍然不理想。因此，了解控制HCC发展和转移的复杂分子机制至关重要。
TGF-β通路在肝脏疾病和肝细胞癌(HCC)中发挥多重作用，既促进肝纤维化和炎症，又抑制肿瘤增殖和促进转移。TGF-β蛋白与受体激酶结合，启动磷酸化依赖的信号级联反应，主要包括SMAD蛋白的下游信号。在癌症进展晚期，TGF-β通过刺激肿瘤细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)促进肿瘤转移，发挥促癌作用。研究人员前期深入研究了TGF-β1/SMAD3经典信号机制，阐明了下游分子PTPRε和JunBP在促进肝癌迁移和转移中的作用。
GPR56在体内外均可促进肝癌的转移
为了研究GPR56对HCC的生物学效应，研究人员使用慢病毒在低表达水平的Hep3B细胞中稳定过表达GPR56，使用3种不同的shRNA在高表达水平的MHCC97H和HLF细胞中稳定敲低GPR56，选择shRNA-2进行了进一步实验。通过划痕实验和迁移实验，研究人员发现GPR56过表达增强了Hep3B细胞的迁移和侵袭能力，而在MHCC97H和HLF细胞中，GPR56敲低减弱了这些能力。这些结果共同证实了GPR56促进肝癌的迁移和侵袭。此外，通过蛋白质免疫印迹实验检测了EMT标志物，研究人员发现在肝癌细胞中上调GPR56促进波形蛋白和闭合蛋白的表达，同时抑制E-钙粘蛋白的表达，表明GPR56具有促进肝癌细胞EMT的能力。此外，研究人员还使用了一种小分子抑制剂DHM，它可以特异性地靶向GPR56，抑制其功能活性。在MHCC97H和Hep3B细胞中使用DHM后，划痕实验和迁移实验表明DHM显著降低肝癌细胞的迁移和侵袭能力。
GPR56在体内外均可促进肝癌的转移
研究人员进一步验证了GPR56在体内的致癌功能。研究人员建立了裸鼠尾静脉肺转移瘤模型和原位肝移植瘤模型。尾静脉肺转移实验显示，与SH-CON组相比，SH-GPR56组荧光强度和肺种植体数量明显减少。与LV-CON组相比，OE-GPR56组荧光强度和肺内种植体数量均升高。与SH-CON组相比，SH-GPR56组原位肝转移模型荧光强度明显降低，肿瘤数量明显减少，生存时间明显延长，肺转移明显减少。OE-GPR56组与LV-CON组相比，荧光强度更高，肿瘤数量更多，肺转移结节增多，生存时间更短。基于这些结果，研究人员得出结论，GPR56促进肝癌的进展和促进转移。
GPR56通过TGFBR1促进肝癌转移
研究人员进一步研究了TGFBR1在GPR56促进肝癌细胞转移中的作用。在Hep3B LV-GPR56细胞中，敲低TGFBR1可降低p-SMAD3的表达。同样，在荧光素酶报告基因检测中，研究人员发现TGFBR1的敲低抑制了GPR56过表达引起的SBE荧光素酶活性的增加。通过划痕实验和迁移实验，研究人员发现TGFBR1的敲低消除了GPR56对细胞迁移和侵袭的促进作用。在过表达GPR56的Hep3B细胞中，研究人员使用小分子抑制剂SB431542抑制TGFBR1的磷酸化。研究人员观察到，当TGFBR1磷酸化被抑制时，肝癌细胞的迁移和侵袭能力同样被抑制。这些发现表明GPR56对TGF-β信号通路的调节依赖于TGFBR1。此外，研究人员构建了在GPR56敲低背景下过表达TGFBR1-WT和TGFBR1-S165D的MHCC97H细胞。研究人员发现，当TGFBR1的第165位氨基酸发生突变时，肝癌细胞中的TGF-β通路受到抑制，其迁移和侵袭能力降低。研究人员通过蛋白质免疫印迹实验检测EMT标志物时发现，在肝癌细胞中重建TGFBR1增强了波形蛋白和闭合蛋白的表达，而抑制了E-钙粘蛋白的表达，表明GPR56通过TGFBR1调控肝癌细胞的EMT。
裸鼠原位移植实验显示，Hep3B-LV-GPR56组中TGFBR1表达下调后，肝脏肿瘤负荷降低，肺转移结节减少，生存时间延长。相反，在MHCC97H-SH-GPR56组中过表达TGFBR1-WT促进肿瘤生长和转移，而过表达TGFBR1-S165D无明显的促癌作用。研究表明TGFBR1参与了GPR56介导的肝癌转移。
研究发现
本研究中，研究人员观察到GAL对高表达GPR56的HCC没有表现出显著的疗效。结合GAL的作用机制，研究人员推测这可能与GPR56诱导的TGFBR1激活有关，表明GPR56和GAL之间存在潜在的竞争相互作用。因此，研究人员使用小分子抑制剂DHM选择性地靶向GPR56。动物实验中，在GPR56高表达的HCC中，DHM和GAL联合治疗确实显示出比单药治疗更好的疗效，显著抑制HCC的转移。这些发现揭示了一种靶向GPR56诱导的HCC转移的新策略。
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