中山大学发文：转移性黑色素瘤新的靶点和治疗策略
10月20日，上海中医药大学与复旦大学以及上海交通大学研究人员合作在期刊《Clinical And Translational Medicine》发表了题为“CircRNome-wide characterisation reveals the promoting role of circAATF in anti-PD-L1 immunotherapy of gallbladder carcinoma”的研究论文，本研究中，研究人员对GBC的环状RNA图谱进行了全面的分析，揭示了GBC特异性的环状RNAs。研究分析发现，环状RNAs在细胞增殖中显著富集，并与癌症相关的标志物有关。特别是，在GBC中，环状AATF上调，与AATF mRNA表达呈正相关，并促进GBC细胞生长。通过整合计算和实验方法，研究人员揭示了环状AATF与CD4+ T细胞丰度和PD-L1水平呈正相关，并增强了抗PD-L1免疫疗法对GBC的临床益处。进一步研究证明，环状AATF通过激活磷酸化的AKT并作为miR-142-5p的海绵来提高PD-L1水平。环状AATF与CD4+ T细胞和PD-L1水平呈正相关，并显示出有助于GBC抗PD-L1免疫疗法的潜力。本研究为环状AATF在GBC肿瘤发展和免疫学中的作用提供了见解，并加速了GBC免疫疗法治疗策略的发展。
背景介绍
胆囊癌（GBC）是常见的胆道恶性肿瘤，是一种极具侵袭性的肿瘤，占胆道肿瘤的80%以上。GBC的发病率在全球范围内存在明显的地域差异，在发展中国家，如东亚和南美国家，发病率较高。目前，手术切除是治疗GBC患者的唯一有效方法，辅助化疗和放疗的预后改善非常有限。不幸的是，大多数GBC患者在诊断时已处于晚期，并伴有早期转移，导致预后不佳，平均生存时间不足一年。尽管免疫疗法在多种癌症中的应用日益广泛，但在GBC中的应用仍然有限。在过去的十年中，靶向程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）的单克隆抗体，如帕博利珠单抗、纳武利尤单抗和西米普利单抗，以及靶向程序性细胞死亡配体1（PD-L1）的药物，已在多种实体肿瘤中进行了探索。然而，目前仍然缺乏可靠的生物标志物来预测免疫疗法的疗效。因此，需要更多地研究其分子机制，以进一步加深对GBC的认识，并为患者发现新的、有效的诊断和治疗靶点提供便利。
越来越多的证据表明，肿瘤细胞能够获得逃避免疫监视的能力，这是恶性肿瘤不受控制快速生长的主要机制之一。因此，激活免疫系统对抗肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法。免疫检查点阻断（ICB）已被证明是有希望刺激抗肿瘤免疫的方法。此外，近期的研究揭示了环状RNA在免疫反应中的作用，表明环状RNA可能是调节人类癌症免疫的重要因素，并可能是潜在的免疫治疗靶点。然而，关于环状RNA如何调节GBC的肿瘤免疫知之甚少。
circAATF增强GBC的抗PD-L1免疫疗法
为了探究circAATF在GBC中的临床应用价值，研究人员进一步研究了circAATF是否与PD-L1相关，PD-L1与CD4+T细胞上的抑制性检查点分子PD-1结合，并在实体瘤的ICB免疫疗法中广泛作为靶点。研究人员对GBC肿瘤样本中circAATF和CD274基因（编码PD-L1蛋白）的表达进行了相关性分析。研究结果显示，circAATF与PD-L1显著正相关。进一步的流式细胞术分析显示，与GBC-SD细胞共培养的PBMC中PD-L1的表达证实，circAATF或AATF mRNA OE诱导了PD-L1的上调表达。然而，在用BSA培养的GBC-SD细胞中，circAATF或AATF mRNA OE并未诱导PD-L1的上调表达，这表明PBMC是诱导circAATF或AATF mRNA诱导PD-L1表达所必需的。然后，研究人员通过IHC检测了来自GBC-SD肿瘤小鼠的样本中的PD-L1丰度，结果显示，转染了过表达plasmid的GBC-SD肿瘤显示出较高的PD-L1表达。此外，circAATF OE转基因小鼠的肿瘤样本中PD-L1阳性细胞所占比例较大。用抗PD-L1治疗的人源化异种移植模型中的小鼠仅比对照组显示出轻微的生存改善。尤其是，用抗PD-L1治疗携带circAATF转染的GBC-SD肿瘤的小鼠显示出较长的生存时间。在人源化小鼠模型中，小鼠在第28天被处死，并取出肿瘤并测量其大小。来自circAATF转染小鼠的肿瘤显示出较小的体积，表明在高circAATF表达的GBC中，抗PD-L1治疗的效率得到了改善。本研究结果还表明，肿瘤生长的抑制不受小鼠体重的影响。在NOZ细胞系转染中也验证了circAATF对GBC抗PD-L1治疗的增强作用。总之，circAATF与GBC中的PD-L1表达呈正相关，并被证明有助于GBC的抗PD-L1免疫治疗。
circAATF增强GBC的抗PD-L1治疗效果
circAATF通过磷酸化的AKT蛋白和提高AATF mRNA水平来上调PD-L1
研究人员随后探究了circAATF如何增强抗PD-L1免疫疗法治疗GBC的潜在机制。研究人员使用双荧光素酶报告基因系统验证了circAATF（包含AATF mRNA的第3和4外显子）与miR-142-5p之间的相互作用。实验结果证实了circAATF与miR-142-5p之间的特异性相互作用。此外，通过FISH实验，研究人员验证了miR-142-5p在SGC-996细胞中的核定位，证明其存在于细胞核中。此外，研究人员确认circAATF可以在SGC-996细胞中吸收miR-142-5p。因此，circAATF OE导致AATF和PD-L1表达增加，而circAATF KD则抑制PBMC共培养的GBC细胞中的AATF和PD-L1表达。另外，在PBMC共培养的GBC细胞中，OE或KD circAATF和miR-142-5p后，AATF和PD-L1的表达变化幅度较小，表明circAATF可能减少miR-142-5p对AATF和PD-L1表达的影响。这些发现表明，circAATF可能通过调节AATF表达来调节PD-L1表达，其中AATF通过miR-142-5p调节PD-L1水平。为了研究circAATF是否通过与蛋白质的相互作用发挥作用，研究人员对circAATF进行了蛋白质沉淀实验。这些结果表明，circAATF的调节作用可能通过磷酸化的AKT-s473来实现。此外，circAATF OE联合miR-142-5p OE对促进GBC细胞生长的影响显著降低，而circAATF KD联合miR-142-5p KD在与PBMC共培养时对抑制GBC细胞增殖的影响较小。另外，circAATF OE与AKT KD联合使用对促进GBC细胞增殖的影响显著降低，而circAATF KD与AKT OE联合使用在与PBMC共培养时对抑制GBC细胞生长的影响显著降低。通过分析表明，circAATF通过激活AKT信号通路在转录水平上调PD-L1表达，通过消除miR-142-5p的抑制作用在转录后水平上调PD-L1表达，从而导致肿瘤免疫逃避模式；circAATF的miRNA 海绵效应还导致线性AATF表达水平升高，直接促进GBC细胞的生长。
结论
本研究表明，circAATF可能成为GBC免疫治疗的有前途的生物标志物和候选药物。大量的患者免疫学研究数据将有助于研究人员在GBC中将这些发现转化为临床应用。
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