福建医科大学黄清玲团队：结肠癌治疗潜在策略
11月14日，福建医科大学黄清玲研究团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“MDM4 inhibits ferroptosis in p53 mutant colon cancer via regulating TRIM21/GPX4 expression”，本研究中，研究人员发现，在人类结肠癌中，MDM4表达显著上调，并且高水平的MDM4表达与携带突变p53的结肠癌患者的不良预后相关。MDM4通过上调E3泛素连接酶TRIM21的蛋白表达水平，抑制了铁死亡标记蛋白GPX4在K167和K191位点的泛素化。MDM4通过这种方式促进GPX4从K48-连接的泛素化转移到K63-连接的泛素化，从而增强了GPX4蛋白的稳定性，抑制了铁死亡，增加了结肠癌患者对化疗的耐药，并促进了结肠癌的进展。这些发现阐明了MDM4通过调节TRIM21/GPX4对p53突变的结肠癌细胞的铁死亡抑制作用，为结肠癌治疗提供了一种潜在的治疗策略。
背景知识
结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。对全球185个国家的流行病学分析显示，2020年全球约有115万例结肠癌新病例，使其成为第五大常见的癌症类型。同时，结肠癌导致约58万例死亡，使其成为2020年导致癌症相关死亡的第五大主要原因。因此，对驱动结肠癌发生和发展的分子机制进行详细研究，并开发有针对性的抗肿瘤疗法，对于改善患者生存率至关重要。
铁死亡是一种新型的程序性细胞死亡形式，其特征是铁依赖性和脂质过氧化的积累。越来越多的证据表明，诱导铁死亡可以抑制结肠癌的生长并克服化疗耐药性。GPX4是谷胱甘肽过氧化物酶家族的成员，是一种含有硒半胱氨酸的蛋白质，它利用谷胱甘肽将有毒的脂质过氧化物还原为无毒的脂质和醇类，从而防止致命的脂质过氧化物和活性氧的形成和积累。人类基因组编码25种含有硒半胱氨酸的蛋白质，但只要保持一定的GPX4活性，缺乏其他硒蛋白的细胞仍能存活和增殖。GPX4对于小鼠胚胎发育也至关重要，敲除或沉默会导致胚胎致死。鉴于其在调节细胞内氧化还原稳态和抑制脂质过氧化物和活性氧积累方面的作用，GPX4成为癌症治疗的有前景的治疗靶点。
p53蛋白是一种关键的转录因子和肿瘤抑制因子，在调控细胞分裂、DNA损伤修复、细胞凋亡和衰老方面发挥着关键作用。在人类肿瘤中，p53发生突变的比例超过50%，其中结直肠癌的突变率为72.69%。这些突变导致肿瘤抑制功能的丧失，并使癌细胞获得功能获得性（GOF）活动，包括增强的增殖、生存、血管生成、迁移和转移能力。
MDM4抑制p53突变的结肠癌细胞中的铁死亡
顺铂是一种二类铁死亡诱导剂，在结肠癌中诱导铁死亡，与埃拉司汀联合使用时在结直肠癌中具有协同促进铁死亡的作用。如前所述，MDM4增强了结肠癌细胞对顺铂治疗的耐药。为了研究MDM4对p53突变结肠癌细胞铁死亡的影响，研究人员进行了克隆形成试验和细胞形态学观察。结果显示，过表达MDM4促进了结肠癌细胞的增殖并增强了其对铁死亡诱导剂RSL3的耐药。使用不同浓度的RSL3治疗后发现，过表达MDM4以及铁死亡抑制剂Fer-1，但不是凋亡抑制剂Z-VAD或坏死抑制剂NEC-1，显著增加了细胞对RSL3的耐药，与对照组相比。过表达MDM4增加了GSH/GSSG比率，抵抗RSL3-诱导的ROS积累，并降低了p53突变结肠癌细胞中的MDA含量。铁死亡的形态学特征包括小的线粒体、密集的膜密度、减少或消失的线粒体嵴以及外膜破裂的线粒体改变。因此，研究人员尝试使用高分辨率显微镜观察细胞的线粒体形态。结果显示，MDM4过表达成功地抑制了RSL3诱导的线粒体破裂和皱缩。
MDM4过表达抑制p53突变型结肠癌细胞的铁死亡
相反，降低MDM4的表达会降低细胞对RSL3的耐药。此外，降低MDM4表达会降低结肠癌细胞对顺铂的耐药，而Fer-1能够恢复细胞对顺铂的耐药。同样地，降低MDM4表达会加剧RSL3诱导的MDA和ROS积累。这些实验结果表明，MDM4能够调节结肠癌细胞中的铁死亡。
为了全面评估 MDM4 抑制对结肠癌的影响，我们在 BALB/c 裸鼠中使用 MDM4 过表达的 HT29 细胞建立了体内异种移植模型。我们研究了 MDM4 抑制剂 NSC146109 和铁死亡诱导剂 RSL3 通过腹膜内注射的治疗效果。在细胞接种之前，我们证实了 NSC146109 在降低 MDM4 蛋白水平方面的功效，并观察到 RSL3 在细胞水平上显著降低 GPX4 表达（图将小鼠随机分为 4 组：溶剂对照组、单独NSC146109组、单独 RSL3 组以及 NSC146109 和 RSL3 联合治疗组。
MDM4抑制剂与铁死亡诱导剂协同作用，在体内抑制p53突变型结肠癌的生长
为了全面评估MDM4抑制剂在结肠癌中的作用，研究人员利用MDM4过表达的HT29细胞在BALB/c裸鼠体内建立了异种移植模型。通过腹腔注射，研究人员研究了MDM4抑制剂NSC146109和铁死亡诱导剂RSL3的治疗效果。在细胞接种前，研究人员确认了NSC146109降低MDM4蛋白水平的有效性，并观察到RSL3在细胞水平上显著降低GPX4表达。将小鼠随机分为四组：溶剂对照组、NSC146109单独用药组、RSL3单独用药组和联合治疗组（NSC146109和RSL3）。
肿瘤是在小鼠右侧腋窝皮肤中注射p53突变的HT29细胞后形成的，在8天的肿瘤生长和药物治疗开始后，肿瘤大小达到约0.3×0.3厘米。在16天的治疗后，将小鼠处死，并收集肿瘤样本。在整个研究过程中，研究人员监测小鼠的体重，观察到各组之间没有显著差异。通过测量皮下肿瘤体积，研究人员发现NSC146109和RSL3均可单独抑制肿瘤生长，其中联合治疗组的抑制效果较为显著。同样，这两种药物均可显著降低肿瘤重量，其中联合治疗组的降低效果较为显著。
研究人员对这四组肿瘤样本进行免疫组织化学分析揭示了几个关键发现。NSC146109有效地降低了MDM4的表达水平，而RSL3治疗显著降低了GPX4的表达。值得注意的是，NSC146109和RSL3的联合治疗显示出更强的降低GPX4水平和增加4HNE表达的效果，4HNE是脂质过氧化相关的铁死亡的标志物。TRIM21的表达模式与GPX4相似，这表明它们在体内可能存在潜在的调节联系。
此外，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了MDM4过表达的转基因小鼠，并与Villin-Cre小鼠交配，对其基因型进行鉴定以获得结肠条件性MDM4过表达。然后对它们的结肠组织进行了免疫组织化学分析，结果显示TRIM21和GPX4的蛋白质水平升高。
结论
本研究结果证实，通过TRIM21介导的机制，抑制MDM4可以增强p53突变结肠癌细胞对铁死亡的敏感性，从而稳定GPX4。这项研究强调了靶向MDM4结合铁死亡诱导剂治疗携带p53突变的结肠癌的潜在治疗价值。
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