中山大学合作发文：结肠癌抗肿瘤治疗新策略
11月19日，中山大学与华南理工大学研究人员合作共同在期刊《Advanced Science》上发表了研究论文，题为“Sustained Endocytosis Inhibition via Locally-Injected Drug-Eluting Hydrogel Improves ADCC-Mediated Antibody Therapy in Colorectal Cancer”，本研究中，研究人员通过对西妥昔单抗治疗的患者进行回顾性分析，发现EGFR内化与CRC患者较差的治疗反应和预后相关。进一步证明，内吞抑制剂PCZ可以将隐藏在细胞内的EGFR移动到细胞表面，以改善治疗性抗体结合。因此，研究人员构建了西妥昔单抗和PCZ共载的热敏水凝胶（Gel@Cmab/PCZ），用于持续抑制内吞作用和有效的西妥昔单抗递送。肿瘤周围注射Gel@Cmab/PCZ在CRC皮下和原位肿瘤模型中表现出较强的抗肿瘤效果，联合化疗完全消除肝转移。在人源化患者来源的异种移植物模型中，单次注射Gel@Cmab/PCZ，其剂量为常规西妥昔单抗剂量的三分之一，可达到91%的肿瘤生长抑制，促进NK细胞向肿瘤组织浸润及其抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用。本研究为提高单克隆抗体介导的CRC抗肿瘤响应提供了一种新的策略。
背景知识
表皮生长因子受体（EGFR）阻断单克隆抗体（MAB）（如西妥昔单抗）是转移性结直肠癌（mCRC）患者的标准治疗药物。抗EGFR治疗联合化疗可提高RAS/RAF野生型（WT） mCRC患者的反应率和总生存率。然而，30%的患者没有获得抗EGFR单抗治疗的临床益处。临床失败通常归因于低初始反应率或治疗后立即迅速耐药。相比之下，携带RAS/RAF突变的CRC患者（例如KRAS G13D）从西妥昔单抗治疗中显示出临床益处。研究表明，虽然RAS/RAF突变状态仍然是临床实践中选择患者的黄金标准，但不足以预测西妥昔单抗的临床反应。因此，发现新的生物标志物，可以预测抗EGFR治疗的疗效，可能会显著提高临床结果。
肿瘤细胞表面抗原的内吞作用是肿瘤对靶向肿瘤表面蛋白的药物产生耐药性的机制之一。表面受体可以在启动杀伤机制之前从细胞表面移除。例如，IgG1治疗性抗体可以引发抗体依赖性细胞毒性（ADCC），其有效性在很大程度上依赖于它们在细胞表面保持足够长时间的富集能力。因此，抑制人表皮生长因子受体2 （HER2）内化增加抗HER2抗体曲妥珠单抗抗HER2+水平的曲妥珠单抗介导的ADCC的有效性。同样，CD20-利妥昔单抗复合物的快速内化降低了对利妥昔单抗治疗的敏感性，阻断CD20内化可以克服利妥昔单抗耐药性。在鳞状细胞癌（SCC）中发现，EGFR内化是西妥昔单抗抗肿瘤活性的一个重要障碍。内吞抑制剂可以促进EGFR在肿瘤细胞表面的积累和固定，从而提高治疗性抗体的结合和ADCC介导的治疗性抗体的临床疗效。联合内吞抑制剂与治疗性抗体的策略目前正在进行用于SCC治疗的I期临床试验。然而，在结直肠癌中，EGFR内化与治疗性抗体的疗效之间的相关性尚不清楚。此外，局部持续给药内吞抑制剂可能进一步改善EGFR在细胞表面的定位，增强西妥昔单抗治疗的疗效。
PCZ增强西妥昔单抗耐药CRC肿瘤细胞表面EGFR表达水平和单克隆抗体介导的抗肿瘤活性
为了研究EGFR在CRC中的表达是否表现出与临床标本相同的异质性，研究人员使用IF染色评估了各种CRC肿瘤细胞系中EGFR的表达和定位。结果表明，EGFR的表达和内吞率在结直肠癌细胞系中存在差异。既往研究证实PCZ抑制B16-F10细胞中PD-L1的内化和A431细胞中EGFR的内化。因此，研究人员探索PCZ是否可以调节EGFR在结直肠癌细胞中的定位。HT29细胞经PCZ处理后，共聚焦显微镜中频分析显示，与未处理的对照组相比，PCZ将HT29细胞的EGFR定位在质膜上。EGFR高表达水平与ADCC疗效呈正相关。因此，研究人员检测了EGFR在不同人类结直肠癌细胞系中的内源性表达。蛋白质免疫印迹（WB）分析显示，EGFR蛋白在HT29和RKO细胞中有较高的表达。于是，研究人员选择这些细胞系进行后续实验。
PCZ增强西妥昔单抗耐药CRC肿瘤细胞中西妥昔单抗介导的ADCC活性并抑制EGFR下游通路
ADCC在西妥昔单抗的抗肿瘤活性中发挥着重要作用，这主要取决于它能够在足够长的时间内保持与细胞表面的结合，从而促进肿瘤清除。在未接受PCZ处理的HT29和RKO细胞中，在4小时的实验期间，西妥昔单抗在质膜和内化结构中的存在程度较低，可能会阻碍ADCC的活性。相比之下，PCZ预处理显著增加了西妥昔单抗与细胞表面EGFR的结合。西妥昔单抗附着在EGFR的配体结合区域，因此EGF-Alexa488染色可以作为西妥昔单抗结合位置的间接标记物。在PCZ处理肿瘤细胞后，观察到EGF细胞表面染色增加，表明与未处理的细胞相比，细胞表面西妥昔单抗结合位点的可用性增加。在体外ADCC实验中，只有16.9%的HT29和28.4%的RKO细胞分别因西妥昔单抗诱导的ADCC而死亡。PCZ培养增加了西妥昔单抗诱导的ADCC， HT29和RKO细胞的杀伤率分别为76.9%和43.7%。
在HT29细胞中，EGFR磷酸化在EGF刺激下增加。PCZ治疗增加了p-EGFR，研究人员的发现一致。此外，检测下游EGFR信号蛋白的表达。在没有配体刺激的情况下观察到p-Akt和p-Erk1/2，表明PI3K/Akt和MAPK/ERK通路被组成性激活。西妥昔单抗治疗降低EGFR磷酸化；然而，在没有EGF刺激的情况下，Akt和Erk的磷酸化水平保持不变。因此，西妥昔单抗单独对西妥昔单抗耐药细胞的信号抑制无效。西妥昔单抗联合PCZ可降低Akt和Erk的磷酸化水平，增强西妥昔单抗的信号抑制作用。这些结果与先前的研究结果一致，这些发现表明广谱内吞抑制剂如PCZ或洛伐他汀可以在内吞抑制过程中阻断下游信号通路。这些结果表明，这种联合策略在多个层面上增强了抗肿瘤疗效。
结论
研究人员证明了EGFR内化与CRC患者对西妥昔单抗治疗的耐药性有关，并且这种关系可以通过药理学调节来提高EGFR靶向治疗CRC的有效性。
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